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       虽然接种**是防控新冠疫情的最有效手段，但面对新的Omicron变异毒株，大多数**和中和抗体的保护效果明显降低。开发新的广谱抗病毒疗法对于治疗COVID-19仍具有重要意义。新冠病毒的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）、PLpro（木瓜蛋白酶样蛋白酶）、3CLpro蛋白酶（主蛋白酶Mpro）及解旋酶等病毒蛋白酶是主要的药物靶点。默沙东与Ridgeback联合开发的RdRp抑制剂Molnupiravir和辉瑞公司的主蛋白酶抑制剂Paxlovid（主要成分为PF-07321332及Ritonavir）均已通过FDA的紧急使用授权。今天我们通过来回顾Paxlovid的发现和研发过程。

       SARS-CoV-2基因组编码pp1a和pp1ab两种多聚蛋白以及四种结构蛋白。SARS-CoV-2的主蛋白酶可在11个不同位点切割多聚蛋白，产生对病毒复制至关重要的非结构蛋白。冠状病毒的主蛋白酶是一种具有三结构域的半胱氨酸蛋白酶，其特征是位于结构域I和II之间具有Cys145-His41催化二联体。主蛋白酶的底物共同特征是P1处存在Gln残基，而已知的人类半胱氨酸蛋白酶均没有在Gln后裂解，因而这为主蛋白酶作为抗病毒 药物靶标提供了潜在选择性。鉴于病毒蛋白酶小分子口服抑制剂在HIV和HCV治疗中取得的成功，以及SARS-CoV-2主蛋白酶在病毒复制中的关键作用，主蛋白酶Mpro成为RdRp之外另一个研究热点。靶向主蛋白酶的药物开发主要集中在底物位点、变构位点和二聚化界面。

       由于SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的主蛋白酶底物结合位点具有100%的序列同源性，辉瑞2002年针对暴发的SARS疫情发现的SARS-CoV-1主蛋白酶抑制剂PF-00835231（化合物1）对SARS-CoV-2主蛋白酶也具有很强的抑制活性，在细胞水平表型出较强的抗SARS-CoV-2病毒活性。

       化合物1的透膜性和口服生物利用度较差，为了克服这一问题，研究人员尝试减少P1’位的氢键供体，分别引入氰基和苯并噻唑-2-基酮两种共价靶头。引入氰基的化合物2在大鼠体内口服吸收显著提高，且保持了较好的代谢稳定性，但体外对主蛋白酶的抑制作用及抗SARS-CoV-2病毒活性均降低。在P1’位引入苯并噻唑-2-基酮、P2位引入环状亮氨酸拟肽类似物后得到化合物3可显著提高透膜性，对主蛋白酶抑制作用降低主要是由于缺少了抑制剂与Gln189之间的氢键相互作用。为了更好地占据S3口袋，研究人员在P3位引入支链非环状基团。引入甲磺酰胺封端得到的化合物4伸向Gln189下方，增强与P3口袋残基的结合，提高与Glu166骨架的氢键相互作用。与化合物3相比，化合物4对主蛋白酶的体外抑制活性，对SARS-CoV-2的抗病毒活性以及口服吸收均得到提高。对P3位封端进行优化，得到三****封端的化合物5，保持了对主蛋白酶的抑制作用，提高了抗SARS-CoV-2病毒活性、透膜性、代谢稳定性和口服生物利用度。将P1’位换成氰基后得到化合物6（PF-07321332），对主蛋白酶的体外抑制活性进一步提高，保持了抗SARS-CoV-2病毒活性和代谢稳定性，提高了大鼠口服生物利用度。通过稀释实验证明PF-07321332是SARS-CoV-2主蛋白酶的可逆性共价抑制剂。与化合物5相比，因PF-07321332更易于合成放大，且溶解性提高，易于制剂给药，故作为临床候选药物开发。

       PF-07321332对所有已知可感染人类的冠状病毒的主蛋白酶均具有较强的体外抑制活性，而对哺乳动物的半胱氨酸、丝氨酸和天冬氨酸蛋白酶没有明显抑制活性。PF-07321332在生理相关的A549和dNHBE细胞模型中也具有强大的抗病毒活性，在细胞病变实验（CPE）中对SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS及人冠状病毒229E均具有强大的抗病毒活性。

       在小鼠体内，PF-07321332在300 mg/kg给药剂量下血浆未结合药物浓度即可长时间维持在体外细胞实验的EC90以上。在SARS-CoV-2小鼠模型中，PF-07321332可保护小鼠因感染病毒导致的体重降低，抑制病毒复制，显著降低小鼠肺部病毒水平，降低肺部病理损伤。PF-07321332在大鼠和猴体内静脉给药后的半衰期分别为5h和＜ 1h。在大鼠和猴体内的2周重复给药**实验中，PF-07321332的体内暴露具有良好的剂量相关性，耐受性良好，未见明显不良反应。

       由于CYP3A4是PF-07321332的主要代谢酶，而CYP3A4的强效抑制剂Ritonavir（RTV）在临床上可作为多个经CYP3A4代谢的蛋白酶抑制剂（如Darunavir、Lopinavir等）的药代动力学增强剂，因此，在健康成人受试者中进行的随机、双盲、安慰剂对照的单次剂量爬坡试验中，考察了PF-07321332单用、与RTV合用（Paxlovid）两种方式，PF-07321332的安全性和耐受性良好，在与RTV合用后，口服血液浓度显著提高，在给药后12h，仍维持在体外抗SARS-CoV-2病毒EC90以上，因此，Paxlovid有望在临床上取得强大的广谱抗冠状病毒活性。

       综上所述，PF-07321332可口服给药，具有良好的选择性和安全性，并可在小鼠模型中防止感染。在I期临床试验中，该药物达到了预期的抑制病毒作用浓度。因此，主蛋白酶抑制剂Paxlovid与RdRp抑制剂Molnupiravir、**联合，有可能进一步增强对新冠病毒疫情的防控。

       参考文献

       1. Owen, D. R. et al. An oral SARS-CoV-2 Mpro inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19. Science. 2021; 374(6575): 1586–1593.

       2. Jin, Z. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature. 2020; 582(7811): 289–293.

       3. Zhang, L. et al. Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved α-ketoamide inhibitors. Science. 2020; 368(6489): 409–412.

       4. Dai, W. et al. Structure-based design of antiviral drug candidates targeting the SARS-CoV-2 main protease. Science. 2020; 368(6497): 1331–1335.

       5. Hoffman, R. L. et al. Discovery of Ketone-Based Covalent Inhibitors of Coronavirus 3CL Proteases for the Potential Therapeutic Treatment of COVID-19. J Med Chem. 2020; 63(21): 12725-12747.