传统的CRISPR组件包括基础版酿脓链球菌Cas9酶(SpCas9)、引导RNA(gRNA)。其中,SpCas9 会在gRNA的指引下与特定DNA结合,并对其剪切。在临床应用中,许多研究团队会构建“医疗包”——将Cas9基因和其他关键组件包裹进一个无害的病毒中,从而进入体内细胞实现遗传缺陷的精准修复。
然而,考虑到SpCas9蛋白由1,368个氨基酸组成,体积太大不能通过病毒包装和递送。对此,科学家们希望设计出更精简版的Cas9。
来自伯克利加州大学的结构生物学家David Savage带领的研究团队利用了一个“定向进化”的计划设计了一个更“苗条”版的Cas9s,并于上周在冷泉港CRISPR年会上分享了最新的研究成果。
改造细则
他们将改造这一蛋白的方法称为:通过迭代凝胶排阻方法最小化(Minimization by Iterative Size-Exclusion Recombination,MISER)。首先,这项技术使用两种酶系统化剪切SpCas9的基因序列,提取出其中编码不同蛋白结构域的部分序列。
随后,David Savage和团队检测这些分割开的基因序列,以验证它们是否仍然保留着Cas9结合DNA的能力。他们将有能力的片段组合起来,并添加了特异的truncated options。迄今为止,他们已经获得了50万种变体。“让我们意外的是,‘缩减’后的Cas9可以忍受巨大的基因缺失,工作良好且灵活。” David Savage解释道。
早前韩国科学家曾在空肠弯曲杆菌中发现了小型的Cas9酶CjCas9,由984个氨基酸组成。现在,这一最新改造再次“升级”,获得的最小化的MISER Cas9突变体仅仅只包含880个氨基酸,约为原始SpCas9大小的三分之二。
突破和挑战
MISER突变不一定可以实现传统CRISPR-Cas9系统所能完成的一切潜能。其中一个障碍是:一些突变的Cas9s可以锁定基因组中的特定靶点,但是并不能切断DNA。
但是,这个功能缺陷的Cas9s同样也是一个方便的工具,可以运送其他分子到达特定的目的地。一个特别强大的CRISPR技术——“碱基编辑”(base editing)则是利用该工具将一种关键酶运送至特定碱基,随后实现单碱基的置换。
哈佛大学的化学家David Liu是全球率先研发出单碱基编辑技术的科学家,他认为此次David Savage团队的研究是“新方法的一个早期应用,能够促进基因编辑领域更接近于一个长期目标”。
其他“升级”版Cas9
CRISPR的“光环”很强大,从基因工具到临床治疗,这一技术有着巨大的潜能。然而,脱靶效应一直是该技术应用的瓶颈之一。如何降低脱靶效应?科学家们想出很多妙招。
2015年末,张锋团队通过改变构成化脓性链球菌Cas9酶的约1,400个氨基酸中的3个氨基酸,研发出“增强型”酿脓链球菌Cas9(eSpCas9),将“脱靶编辑”显著减少至无法检测到的水平。2016年初,麻省总医院的研究团队猜测,降低Cas9酶与靶DNA之间的互相作用或许可以更加完全地消除脱靶效应。为了验证推测,他们通过替换DNA链重组Cas9酶变体,最终获得SpCas9-HF1,证实其可以显著降低脱靶效应。(详细)
2017年,CRISPR“女神”Jennifer A. Doudna团队利用单分子FRET((Förster resonance energy transfer)技术发现,Cas9与sgRNA形成的复合物中的REC3结构域负责感知靶向结合(target binding)的准确性,然后向REC2结构域发出信号,让其为HNH核酸酶域打开一条通路,最终激活Cas9的“剪刀作用”。通过改变REC3部分,研究团队设计出了一种改良版的、超精确的(hyper-accurate)Cas9——HypaCas9,有望克服脱靶效应。(详细)
2018年,David R. Liu团队带来了“升级版”的Cas9 变体——xCas9, 证实其在基因编辑时更灵活、更精确,可以靶向更多的基因位点,并减少“错误编辑”的风险。他们发现,相比于Cas9,xCas9错误编辑的概率降低了。
此外,科学家们还找到了靶向RNA的基因编辑酶C2c2(Cas13a)、CasRx(Cas13d)以及有任意切割单链DNA潜能的Cas12a(Cpf1)……未来,我们期待更多的基因编辑酶,给予更多的用途和潜能。
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