慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染在全球范围内是导致肝 脏疾病的常见原因，在东南亚地区疾病负担尤其严重。根据世界卫生组织（WHO）估计，全球有大约2.57亿HBV感染患者。目前，**、核苷或核苷酸（NUC）类药物不但能够降低新感染率（new infection rates），而且对于坚持长期病毒抑制疗法的HBV患者来说，能够延缓肝病的进展。然而科学和医学界并不满足于现状，他们已经开始共同努力，开发旨在治愈这一感染的创新抗病毒 药物和免疫学疗法。近日Nature Reviews Drug Discovery上的一篇综述对目前治疗HBV感染的研发策略进行了全面的盘点。药明康德内容团队今天将与读者分享这一综述的精彩内容。

   功能性治愈HBV感染面对的挑战

       共价闭合环状DNA（cccDNA）

       HBV能够在被感染细胞的细胞核中生成cccDNA和整合序列。这些序列是病毒蛋白的转录模板。cccDNA是生成前基因组RNA（pgRNA）的模板。pgRNA提供了逆转录和病毒基因组复制所需的模板。

       cccDNA是一个病毒微型染色体（minichromosome），它是导致病毒在受到感染的细胞中长期存在的原因。它的半衰期非常长，目前的标准疗法不能有效清除cccDNA。

       ▲cccDNA的表观遗传学调控（图片来源：参考资料[2]）

       HBV的特殊免疫特征

       HBV具有的一些重要免疫学特征让它们能够长期存在并且不易清除。HBV在肝细胞内的复制不会被细胞内的先天免疫系统察觉。HBV能够生成和分泌大量病毒抗原，逐渐改变和耗竭HBV特异性T细胞和B细胞的功能。即便使用目前的标准疗法，免疫反应的缺陷导致患者很难将HBV特异性免疫力恢复到正常水平，因而无法有效控制感染。

       HBV的生命周期和创新治疗手段

       HBV的基因组是长为3.2kb的松弛环状DNA（rcDNA）基因组。它与聚合酶一起包装在病毒衣壳中，外面覆盖着包膜蛋白（HBsAgs）。HBV的生命周期可以分为以下几步：

       HBV通过与肝细胞表面的NTCP受体相结合进入细胞，而后，病毒脱去包膜蛋白，衣壳进入细胞核，释放环状DNA。宿主的DNA修复机制会将这些外源DNA转换成cccDNA。它们与宿主的组蛋白和其它蛋白一起包装成微型染色体。这种微型染色体是肝细胞核中长期存在的病毒基因组储备库，它的数量可以通过感染新肝细胞和细胞间核衣壳的回收而不断增加。

       cccDNA是生成pgRNA的模板，它需要肝炎X蛋白（HBx）才能维持正常表达。cccDNA转录生成6种RNA，其中包括与HBV聚合酶结合的pgRNA。

       与pgRNA 结合的聚合酶通过与核蛋白和P蛋白构成的6聚体结合，启动核衣壳的组装。

       prgRNA在未成熟的核衣壳内引导松弛环状DNA的合成，生成成熟的核衣壳。

       成熟核衣壳如果与HBsAg相结合，会引发病毒获得包膜蛋白，并且被释放到细胞外。

       ▲HBV的生命周期（图片来源：参考资料[2]）

       目前，多种创新疗法可以靶向HBV生命周期中的这些步骤，达到降低病毒负荷的目的。

       防止HBV进入细胞

       病毒的不断复制和释放会导致新的肝细胞被感染，从而维持慢性感染和cccDNA库的稳定。在大多数患者中，NUC疗法无法完全抑制病毒产生。因此，将病毒进入抑制剂与复制抑制剂联用是减少cccDNA库的有力手段。

       防止病毒进入细胞的方法包括开发从HBsAg中衍生的多肽。它可以通过与NTCP受体结合，阻碍HBV病毒进入细胞。例如Myrcludex B（又名bulevirtide），这款多肽作为单药疗法，能够在48周之后，将HDV的RNA水平降低2.84 log。它与干扰素联用的效果更好。

       除了多肽以外，小分子药物（例如ezetimibe和环孢素衍生物）和靶向HBsAg的单克隆抗体也在研究中被用于阻断HBV进入细胞。

       直接靶向cccDNA

       抑制cccDNA的生成是一个有吸引力的策略。然而，我们需要对cccDNA合成的过程具备更全面的了解，才能靶向这一过程。因为cccDNA生成过程中的很多关键步骤需要宿主细胞核中的蛋白酶，微型染色体的形成也需要宿主的组蛋白和其它蛋白。抑制cccDNA生成的疗法可能会靶向宿主蛋白，它们可能比靶向病毒蛋白的疗法具有更多的毒副作用。

       锌指核酸酶（zinc-finger nucleases）可以被用来直接靶向cccDNA，这一策略在细胞培养模型中已经能够成功编辑HBV的cccDNA。

       基于CRISPR-Cas9的治疗方法可以在cccDNA中加入突变或者缺失，导致cccDNA失活。临床前研究表明，超过90%的HBV DNA可以被Cas9切割。然而，大约7%的cccDNA基因组在经过CRISPR-Cas9介导的切割之后，能够被修复成不影响cccDNA功能的状态。因此，这一策略需要引入靶向cccDNA中不同位点的多个指导RNA（gRNA），确保cccDNA的失活。

       基因编辑疗法的继续开发需要解决肝细胞递送、脱靶效应等挑战，然而，目前这是唯一一种在组织中让cccDNA永久性失活的方法。

       靶向病毒基因表达

       高病毒抗原负荷被认为在维持慢性感染中起到重要作用，因此，通过沉默cccDNA的转录或者降解病毒RNA来降低病毒抗原的表达水平也获得研究人员的关注。

       基于核苷酸的抗HBV疗法使用RNA干扰或反义寡核苷酸（ASO）来降低HBV mRNA的水平。业界的普遍观点是靶向HBV mRNA是治愈性疗法的重要组成部分。它可以限制HBsAg的表达，从而帮助HBV特异性免疫力的恢复。这一技术平台的另一个特点是可以通过对靶点序列的筛选，设计出同时靶向多种HBV mRNA的疗法。

       ▲RNAi疗法靶向病毒mRNA的示意图（图片来源：参考资料[3]）

       Arrowhead公司开发的RNAi疗法ARC-520在临床试验中的表现展现了这类疗法的潜力。如今的第二代HBV RNAi疗法已经在临床试验中表现出可喜的疗效。例如JNJ3989（ARO-HBV）能够将HBsAg蛋白水平平均降低1.7-2.0 log。

       ASO疗法通过RNase H降解靶点RNA序列，与RNAi疗法类似，它需要多个ASOs来应对不同患者之间出现的序列变异。Ionis Pharmaceuticals公司开发的两款ASO疗法在临床2期试验中也获得了可喜的结果。日前葛兰素史克（GSK）公司决定获取这两款疗法的后续开发和推广权益。

       在治愈性潜力方面，我们目前还不了解需要将HBsAg水平降到多低，维持多久，才能够导致HBV特异性免疫力的恢复。目前正在进行的2期临床试验可能为回答这些问题提供洞见。可能在降低HBsAg水平之后，我们需要另一种免疫刺激手段来完全发挥抗病毒免疫反应的潜力。

       靶向衣壳组装步骤

       将衣壳组装抑制剂与NUC联用可能进一步降低病毒水平，从而在慢性乙肝患者中提高HBV特异性免疫反应的恢复。目前抑制衣壳组装的小分子药物可以分为两类：核蛋白异构调节剂（CpAMs）可以导致非衣壳核蛋白多聚体的组装错误（例如GLS4和RO7049389）；衣壳组装调节剂可以让衣壳正常组装，但是不包含病毒核苷酸（例如AT-130， NVR-3778， JNJ6379等）。这两类抑制剂不但可以减少病毒颗粒的释放，而且可以阻断核衣壳向细胞核的运输，从而降低cccDNA的形成。

       图片来源：参考资料[4]

       在短期临床试验中（小于12个月），衣壳组装抑制剂能够降低HBV的DNA和RNA水平。例如，在施药期结束之后，NVR-3778能够让HBV的DNA水平降低1.72 log，JNJ6379的表现为2.16-2.89 log。

       靶向HBsAg的释放

       核酸聚合物（nucleic acid polymers, NAPs）由于其两性聚合物（amphipathic polymers）的特性，可以产生抗病毒作用。它们对HBV感染的特殊作用在于能够抑制受到感染的肝细胞释放HBsAg。近来的临床试验表明，Replicor公司开发的REP2139（一种核酸聚合物），和富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF）和聚乙二醇化干扰素α2a（peg-IFN）联用，能够达到对80%的HBV感染患者的“功能性控制”。

       免疫调节疗法

       协同激活人体的抗病毒免疫力可能导致HBV的功能性治愈。HBV受到控制的患者表现出协调的HBV特异性激素和细胞免疫反应。他们针对不同的病毒抗原产生强劲的T细胞反应，并且B细胞能够分泌抗HBV抗体。因此，激活免疫机制让人体自发清除HBV感染，可能成为治疗慢性HBV感染的一种治疗手段。

       靶向先天免疫力的治疗策略

       靶向先天免疫力的疗法主要利用细胞因子（TNF，IFNα，IFNγ和IL-1β）的抗病毒效应，它们同时能够诱发适应性免疫力。IFNα就是基于这一原理。IFNα疗法能够在5-10%的慢性乙肝患者中达到功能性治愈。这一疗法的作用机理在于IFNα不但具有直接抗病毒效果，而且可以提高自然杀伤（NK）细胞的反应。而且，接受IFNα治疗后达到HBsAg阴性的患者恢复了HBV特异性T细胞反应。

       抗病毒细胞因子还有可能清除cccDNA，这是治愈慢性乙肝患者最直接和有效的方法。体外研究表明，IFNα或淋巴毒素-β（lymphotoxin-β）可能诱发对病毒DNA的APOBEC依赖性脱氨基作用。这可能降低受到感染的肝细胞中的cccDNA水平。

       在慢性乙肝患者中激活先天免疫力还可以通过Toll样受体（TLR）或RIG-I激动剂来实现。RIG-I激动剂能够在肝细胞中直接激活先天免疫力，而TLR7或TLR8激动剂能够激活肝细胞周围的免疫细胞。名为inarigivir的RIG-I激动剂同时具有直接抗病毒效应。在临床试验中，它能够剂量依赖性降低HBV的DNA和RNA水平，而且26%的患者HBsAg水平出现下降。

       TLR7激动剂GS-9620能够在浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells）中激活IFNα的生成。TLR8激动剂能够强力激活肝内单核细胞和树突状细胞生成和分泌IL-12和IL-18。而IL-12和IL-18会激发IFNα的生成，而且IL-12可以部分恢复耗竭HBV特异性T细胞的活性。

       靶向适应性免疫力的策略

       HBV特异性免疫反应在慢性乙肝患者中出现缺陷。理论上这一缺陷可以通过免疫检查点抑制剂（例如抗PD-1或抗CTLA-4疗法）或治疗性**来解决。抗PD-1疗法在慢性乙肝患者中显示出一致但是有限的抗病毒活性，然而研究人员仍然需要确定筛选患者的标准和抗PD-1疗法的剂量。治疗性**目前尚未取得显著疗效。

       这些免疫疗法疗效不佳的原因可能与慢性乙肝患者的抗HBV免疫反应相关。在慢性患者中，HBV特异性T细胞非常稀少，而且显示出耗竭表型。而且，阻断PD-1信号通路可能要与其它细胞因子疗法联用才能够让HBV特异性B细胞恢复活性。

       利用基因工程，生成靶向HBV的TCR-T细胞疗法或者CAR-T疗法可以帮助克服这一障碍。这类疗法在体外和动物试验中能够识别HBV感染的靶标。然而，因为制造T细胞疗法的过程非常复杂，这限制了临床试验的进展。

       展望未来

       业界逐渐达成的共识是：我们需要具有创新作用机制的组合疗法才能达到功能性治愈的目标。这些疗法需要达到以下目标：完全抑制病毒生产和从头感染（de novo infection）；完全抑制HBsAg的产生；适当激活免疫系统，提高HBV特异性适应性免疫反应；在肝 脏中安全控制免疫反应的强度。

       在设计检验组合疗法的临床试验时，我们需要具有坚实的科学基础，在临床前阶段了解不同疗法的潜在重叠毒副作用，从而在临床试验中及时评估负面反应和潜在药物相互作用。

       在科研人员的不懈努力之下，我们期待早日克服功能性治愈慢性乙肝患者需要面对的挑战，为世界各地的患者造福。

       参考资料：

       [1] Fanning et al., (2019). Therapeutic strategies for hepatitis B virus infection: towards a cure. Nature Reviews Drug Discovery. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0037-0

       [2] Nassal., (2015). HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. BMJ Gut, http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2015-309809

       [3] RNAi: Pulling Us Toward Finite Therapy. Retrieved August 28, 2019, from http://ir.arrowheadpharma.com/static-files/d6073d43-ba9d-4f8e-b68e-9ba990e59375

       [4] HBV Treatment Pipeline: Prospects for a CureRetrieved August 28, 2019, from http://media.mycme.com/documents/304/17_peters_final_75913.pdf