非标记方法已经成为探索小分子靶点识别的重要技术，尤其适用于结构修饰受限的天然小分子化合物。非标记药物靶标发现技术聚焦于小分子结合后引发的靶蛋白稳定性变化，如热稳定性、抗水解能力或化学稳定性的变化。通过先进的蛋白质组学分析策略，能够精准捕捉这些微妙变化，进而揭示出隐藏的靶蛋白身份。具体而言，非标记靶点鉴定工具箱中包含了诸如DARTS（药物亲和响应靶标稳定性分析）、SPROX（基于氧化速率的蛋白质稳定性评估）以及CETSA（细胞热位移分析）或TPP（热蛋白质组学分析）等先进技术。这些方法各有千秋，通过不同机制监测蛋白质在小分子结合后的稳定性变化，为药物作用机制的阐明及新靶点的发现提供了新颖且高效的途径。这些技术的融合应用，拓宽了靶点鉴定的边界，也为 药物研发 领域的创新注入了新的活力。

图一 非标记药物靶标发现技术

       1. DARTS（药物亲和响应靶标稳定性分析）

       2009年，Lomenick团队创新性地推出了DARTS技术，旨在精准定位小分子药物的直接作用靶点。该技术基于一个关键发现：当药物与靶蛋白紧密结合时，靶蛋白对蛋白酶的敏感性显著降低，展现出增强的稳定性与抗水解能力。实验中，他们选用枯草杆菌蛋白酶作为工具，针对雷帕霉素与FK506的共同靶点FKBP12进行测试。结果显示，FKBP12与这两种药物结合后，其抗蛋白酶水解能力显著增强，有力证实了DARTS技术在靶点鉴定中的有效性和可靠性。尤为值得一提的是，DARTS方法无需对小分子化合物进行复杂的结构标记，大大拓宽了其应用范围，展现出极高的普适性和实用性。

       随着DARTS技术的深入发展，其应用领域已经拓展至天然产物的靶点鉴定。Morretta等研究表明，利用DARTS技术成功揭示了软珊瑚属Sinularia中分离的二萜5-epi-sinuleptolide作用于肌动蛋白Actin，通过干扰肌动蛋白骨架实现抗癌效果。Cai等则通过DARTS确认了桦木酸(BA)靶向葡萄糖调节蛋白78(GRP78)，激活内质网应激诱导的细胞凋亡路径。Wang等的研究进一步展示了DARTS在鉴定盐霉素功能性靶点核仁素(NCL)中的作用，该靶点涉及抑制神经母细胞瘤干细胞活性。为提升DARTS的蛋白质覆盖率，研究人员将DARTS样品与蛋白质质谱分析相结合，有效拓宽了靶点鉴定范围。例如，隐丹参酮和牛蒡子苷元的靶点分别被鉴定为FK506结合蛋白1A(FKBP1A)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)。尽管DARTS在天然产物靶点鉴定中展现出巨大潜力，但其对低丰度靶点的检测能力受限，且靶蛋白水解敏感性和蛋白酶、细胞裂解液的选择均可能影响技术效果，这些挑战仍需进一步研究和优化。

       2、SPROX（基于氧化速率的蛋白质稳定性评估）

       SPROX技术基于过氧化氢诱导的甲硫氨酸氧化，在化学变性剂存在下，评估蛋白质的抗氧化稳定性变化，以识别小分子化合物的蛋白质靶点。该方法涉及蛋白质样品的折叠-去折叠平衡、甲硫氨酸氧化及后续定量分析。Dearmond等利用SPROX在酵母中鉴定了白藜芦醇的多个靶点，包括细胞溶质醛脱氢酶和与翻译相关的蛋白。Geer Wallace等则发现manassantin A通过靶向丝蛋白A和延伸因子1a抑制HIF-1a激活，展示其抗癌潜力。然而，SPROX受限于蛋白质中甲硫氨酸的低含量（约2.5%），且仅适用于细胞裂解物分析，不适用于活细胞系统，从而限制了其蛋白质组检测范围。

       3、CETSA（细胞热位移分析） 或 TPP（热蛋白质组学分析）

       CETSA（细胞热转换分析）技术通过加热蛋白质样品，评估其热稳定性变化来鉴定天然产物的靶蛋白。与天然产物结合的蛋白质在较高温度下仍保持稳定，而未结合者则降解或沉淀。CETSA适用于活细胞、细胞裂解液及组织样品，通过蛋白质免疫印迹或蛋白质组学分析熔解曲线，计算Tm值来鉴定靶蛋白。尽管CETSA广泛适用于多种样品和蛋白质，但灵敏度有限且需高药物浓度。TPP（MS-CETSA）技术进一步提升了CETSA的通量和灵敏度，通过TMT标记和LC-MS/MS分析识别靶点。CETSA及TPP在学术研究中展现了其鉴定天然产物靶点的潜力，如大麦芽碱的核磷蛋白靶点、抗疟药物的PfPNP靶点等。然而，CETSA及TPP也存在耗时、成本高及缺乏结构域结合信息的局限。尽管如此，CETSA技术在蛋白质种类和样品类型上的广泛应用范围仍是其显著优势。

       小结

       非标记方法在靶点识别中崭露头角，特别适用于天然小分子与靶蛋白的低亲和力互作研究。这些技术通过监测靶蛋白的稳定性变化，利用先进的蛋白质组学技术，精准揭示隐藏靶点。DARTS、SPROX、CETSA及TPP等技术的互补应用，为药物机制研究和新 靶标 发现提供了高效手段，同时促进了药物研发领域的创新与发展。

       参考文献：

       Label-Free Proteome Profiling as a Quantitative Target Identification Technique for Bioactive Small Molecules，Biochemistry.